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免疫印迹技术
浏览次数:4464发布日期:2012-06-11

(一) 基本原理 免疫印迹又称Western印迹(Western  blot),与DNA的Southern印迹技术相对应,两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜),然后用探针检测特异性组分。不同的是,Western blot所检测的是抗原类蛋白质成分,所用的探针是抗体,它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点,具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测,以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。

目前,Western blot广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。

(二) 基本方法 先将待检测样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中,经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分离各组分,然后通过印迹技术把分离样品几乎原位、定量转移到NC膜上。随后进行类似间接ELISA法测抗原的反应,即用特异抗体与NC膜上的靶抗原反应,结合上的抗体可用与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白进行反应,zui后通过与酶的底物发生显色反应来做检测。

实际操作时,常把印迹后的NC膜分成两部分,一部分如上所述做免疫检测,另一部分直接进行蛋白质染色,以便对转移情况做直接观察和判断待测抗原所处位置及推算其分子量。

操作方法具体如下:

1.样品的制备 样品的制备方法的选择取决于样品的类型和待测抗原的性质。细菌样品一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解。哺乳动物组织通常可机械分散并直接溶于SDS凝胶加样缓冲液。组织培养的单层细胞可用去污剂温和裂解,也可直接在SDS凝胶加样缓冲液中裂解。制备好的样品用做SDS-PAGE分析。

2.蛋白质的SDS-PAGE分析 PAGE过程有三种物理效应可使样品分离开来,包括样品的浓缩效应、凝胶的分子筛效应、一般电泳的电荷效应。因此,样品分离效果好,分辨力高。

SDS-PAGE是将强阴子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)与还原剂巯基乙醇并用,并通过加热,使蛋白质解离成多肽后再加样于电泳凝胶上。由于各种SDS-多肽复合物均带负电,且形状近似,因此,该复合物在电场中的迁移率只取决于蛋白质的大小,这样通过SDS-PAGE可将不同大小的蛋白质样品分离开来,借助已知分子量的标准参照物,可推算出相应的分子量。(三)将蛋白质从凝胶转移到NC膜上  操作方法如下:

(1) 剪6块粗滤纸和一块NC膜(大小应与凝胶一致),并在转移缓冲液(48 mmol/L Tris.HCl,39 mmol/L甘氨酸,0.037%SDS)中浸泡3-5分钟。

(2) 将转移电泳槽塑料支架平放,依次置放海绵、3块滤纸、NC膜、凝胶及另外3块滤纸和海绵,放置过程注意驱除夹层间气泡。用支架夹紧上述各层,置电转移槽中,NC膜一侧靠正极,凝胶一侧靠负极。

(3) 接通电源,40V、约1.转移1.5-6小时。转移时间长短依靶蛋白分子量大小来调节。

(4) 转移结束,取出NC膜做好上、下端标记,切下一小条做蛋白质染色处理,以检查转移效果。

(5) 将NC膜置干净滤纸上,室温自然干燥。

4.封闭 这一步处理的目的在于封闭NC膜上一些非特异性蛋白质的潜在结合位点,以避免非特异性反应。通常是在PBS缓冲液中加入1%脱脂奶粉或牛血清白蛋白配成封闭液,并将 NC膜浸泡其中,室温封闭1小时左右。

5.(五)免疫检测和显色反应 包括NC膜与*抗体、酶标抗抗体(即第二抗体)反应,以及用酶相应的底物处理进行显色反应。

(1) 将封闭好的NC膜浸入*抗体溶液中,抗体液依0.2ml/cm2调节用量,室温或37℃温和振荡反应1-2小时。

(2) 弃去抗体液,用PBS洗涤。

(3) 将NC膜浸入酶标第二抗体反应液,用量与一抗相同,37℃或室温轻振荡1-2小时。

(4) 弃二抗反应液,PBS洗涤。

(5) 将膜放入相应显色液中,观察显色反应。阳性反应将在靶蛋白相对应的位置上出现有颜色的条带,而其余位置无显色条带出现。

(三) 免疫印迹技术的应用实例 用免疫印迹技术可定性、定量地检测出待检样品中含量很低的特定病原体的抗原成分。对于一些能感染细胞而细胞病变不易观察的病原体的检测也很有用。用单克隆抗体做为*抗体进行免疫印迹,还可以对毒株做分型研究。

1990年,西班牙等一些发现有非洲猪瘟的国家已将ELISA结合Western blot技术广泛应用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的检测以帮助实施ASFV扑灭计划。先用ELISA技术对大批血清样品进行初筛,随后用Western blot技术对阳性样品进一步做验证,可有效排除假阳性反应。 1995年,Alcaraz.C等应用基因工程技术成功建立了特异性更为理想的重组Western blot技术。他们用大肠杆菌系统克隆并表达了ASFV抗原性病毒结构蛋白p54,将重组p54做为抗原建立了Western blot检测技术。原有的Western blot技术所用的抗原是通过病毒感染哺乳动物细胞而分离获得,不可避免有细胞杂蛋白干扰。而应用重组蛋白做为抗原,成分专一,可保证检测结果的高度特异,还能避免将活毒应用于检测试验所可能带来的散毒危险。

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